La inmunoelectroforesis es el nombre genérico que reciben un amplio número de métodos bioquímicos para la separación y caracterización de proteínas basadas en la electroforesis y la reacción con anticuerpos. Todas las variantes de la inmunoelectroforesis requieren inmunoglobulinas, anticuerpos que van a reaccionar con las proteínas que se desea separar o caracterizar. Los métodos fueron desarrollados y usados ampliamente durante la segunda mitad del siglo XX.[1]
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T.2 TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO
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Reacción antígeno anticuerpo
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Reacciones inmunoserologicas.wmv
Transcription
Hola. Hoy vamos a profundizar en las técnicas de inmunodiagnóstico y en ver cómo se obtienen sus herramientas indispensables: los anticuerpos. El inmunoensayo es la técnica por excelencia para el laboratorio de inmunología y para otros y necesitamos los anticuerpos monoclonales o policlonales. Muy rápidamente recordamos lo visto en píldoras previas. La reacción antígeno-anticuerpo que se va usar para determinar concentraciones de células se puede manifestar por las caracerísticas de estas redes como la capacidad de dispersar la luz la turbidez que producen en suspensión y su capacidad de precipitar o aglutinar. Son las técnicas de aglutinación que veremos en píldoras siguientes. El anticuerpo se puede combinar con varias sustancias lo que amplica la diversidad del uso de estas moléculas. Se combina con enzimas y tenemos técnicas de enzimoensayo con sustancias radioactivas aunque estas técnicas estén más en desuso y, por último, con sustancias fluorescentes para luego hacer un examen al microscopio o con otros aparatos fluorímetros o citómetros que detectan la fluorescencia. A lo que íbamos en esta píldora: cómo producir estos anticuerpos en el laboratorio. Para ello hay que inyectar en un animal una suspensión de los antígenos. Utilizaremos un ratón para obtener anticuerpos monoclonales y un conejo para obtener anticuerpos policlonales. En el caso de los policlonales se puede utilizar otras especies como las cabras o las ovejas pero, sobre todo, los conejos, insisto. Lo primero que necesitamos es una suspensión del antígeno que hay que preparar e inyectar en la cavidad peritoneal del animal en este ejemplo, del ratón y se deja que se produzca una respuesta inmunológica primaria. Pasados entre siete y diez días de esta primera inmunización realizaremos otra inmunización con el mismo antígeno. Con esto se busca una respuesta secundaria de memoria más potente y con mayor número de células. Entonces se sangra al animal y se va a analizar la sangre para ver la presencia en ella de anticuerpos. Aunque si separamos el suero tendremos una mezcla de anticuerpos dirigidos a los distintos epítopos que tenía el antígeno, el rojo, el azul o el verde. Serían anticuerpos policlonales. Para llegar al monoclonal necesitamos el bazo del animal. Aquí tendremos clones específicos de nuestro antígeno de interés y clones inespecíficos del antígeno, como los grises. Para buscar los que nos interesan primero hay que fusionar las células B con unas células tumorales, un mieloma. Aquí se ve cómo se produce esta fusión. Estas células fusionadas son hibridomas. Tienen la capacidad del tumor de recrecimiento permanente y la capacidad del linfocito B de generar anticuerpos. Después hay que ver cuáles se han fusionado y cuáles no. Para ello se ponen en un medio selectivo y acaban muriendo los linfocitos T sin fusionar. Después hay que ver cuál de las células B se ajusta al antígeno de estudio. Para ello hay que hacer la técnica de dilución límite que calcula que podemos sembrar en un pocillo una o menos células B. En este caso son hibridomas pero capaces de producir anticuerpos. Habrá algunos clones que producen anticuerpos de interés y otros que producen anticuerpos irrelevantes para nuestro interés de diagnóstico. Después de unos días en un incubador en determinadas condiciones estas células se replicarán y formarán los clones que sintetizarán inmunoglobulina. En los que no había células, no hay crecimiento y no hay anticuerpos. Ahora hay que saber cuál de estos seis ejemplos produce anticuerpos frente al epítopo de interés o cuál es irrelevante. Hacemos réplicas de las placas y haremos inmunoensayos enfrentándolos a nuestro antígeno de interés para ver cuál reacciona y cuál no con nuestro antígeno y, por tanto, cuál de estos clones es un anticuerpo monoclonal que interese para la técnica que estamos diseñando. Hemos dispensado la placa y ponemos los clones en contacto con nuestro antígeno original. Veremos cuál produce reacción y cuál no. En los que no hay crecimiento, no se va a producir reacción. Donde hay anticuerpos algunos reaccionarán frente a las partículas del antígeno y en otros pocillos habrá anticuerpos que no reaccionen. En los que hay reacción estarán los anticuerpos monoclonales que son los marcados como reacción positiva y los de reacción negativa ya no los vamos a usar. Vamos a hacer una resiembra con los de reacción positiva de estos hibridomas en gran cantidad de líquido. Lo metemos en un incubador para obtener lo de la imagen: muchísimas células B productoras de mucha cantidad de anticuerpo que utilizaremos para la técnica. Los hibridomas se pueden reinyectar en los animales también y en el líquido ascítico se puede obtener una gran cantidad de anticuerpos como vemos en la imagen. Reacciona en el animal y se produce en cantidades masivas. Así hay dos maneras de obtenerlo en grandes cantidades. ¿Está listo ya el anticuerpo para las técnicas diagnósticas? Para algunas. Para otras habrá que conjugarlo con enzimas con sustancias fluorescentes o radioactivas entre otras. En esta píldora hemos repasado las técnicas de inmunoensayo que se utilizan en el diagnóstico la metodología básica para producir anticuerpos policlonales y la metodología para producir anticuerpos monoclonales. Podrías preguntarte si sabes las siguientes cuestiones: Para las técnicas de aglutinación y precipitación ¿es mejor usar anticuerpos monoclonales o policlonales? ¿Qué anticuerpos se utilizan para técnicas de inmunofluorescencia? ¿En qué animales se producen los anticuerpos policlonales? ¿En qué animales se producen los anticuerpos monoclonales? ¿Cuántas inmunizaciones se necesitan para obtener anticuerpos? ¿Los anticuerpos monoclonales se obtienen del bazo del animal? Los anticuerpos monoclonales obtenidos en animales ¿sirven para todas las técnicas sin más modificaciones? Si lo sabes todo vete ya a estudiar las técnicas sino, dale un repaso y nos vemos en la próxima. Hasta pronto.
Procedimiento
Se suele utilizar un gel de agarosa al 1% con un grosor cercano al milímetro, y un pH en torno al 8,6. Esto sirve tanto para la electroforesis como para la reacción con los anticuerpos. Se prefiere la agarosa como matriz de soporte porque tiene un tamaño de poro mayor que otros medios, que permiten el libre paso y separación de las proteínas, pero en cambio es lo suficientemente estrecho como para impedir el paso de los complejos antígeno-anticuerpo. El elevado pH se utiliza porque, en esas condiciones, los anticuerpos son prácticamente inmóviles. Se suele emplear una bañera de electroforesis de tipo horizontal.
Los complejos de inmunoprecipitación se pueden ver en el mismo gel de agarosa, pero requieren ser teñidos con colorantes para proteínas tales como el Azul Coomassie. En contraste con la electroforesis en gel SDS, la electroforesis en gel de agarosa permite que las proteínas estén en forma nativa (estructura cuaternaria), por lo que la inmunoelectroforesis permite la caracterización de la actividad enzimática y la unión a ligandos además de la separación electroforética.
Tipos
En orden de aparición, los métodos inmunoelectroforéticos fueron:
- Análisis inmunoelectroforético (Inmunoelectroforesis de una dimensión)
- Inmunoelectroforesis cruzada (Inmunoelectroforesis cuantitativa en dos dimensiones)
- Inmunoelectroforesis en cohete (Inmunoelectroforesis cuantitativa de una dimensión)
- Contrainmunoelectroforesis
- Inmunoelectroforesis de afinidad
El Análisis inmunoelectroforético es el más clásico de los ensayos. Se fundamenta en la separación de las proteínas por electroforesis, tras la que se aplica, sobre el gel de agarosa, el suero de anticuerpos sobre las proteínas ya separadas, tras lo que se forma un precipitado tras un período adecuado de difusión, para permitir que las proteínas se encuentren con sus anticuerpos específicos. La introducción de este ensayo conllevó un gran avance de la química de las proteínas, y muchos de los descubrimientos de proteínas en líquidos y extractos biológicos se realizaron por este método: permitió caracterizar un gran número de proteínas en suero y además se pudo establecer la existencia de distintas clases de inmunoglobulinas y sus diferentes características electroforéticas.
La inmunoelectroforesis cruzada, también llamada Inmunoelectroforesis cuantitativa de dos dimensiones, difiere del método anterior en el hecho de que las proteínas, tras su electroforesis inicial, no se incuba con anticuerpos. En su lugar, se vuelven a someter a una segunda electroforesis, esta vez en un gel que además de buffer y agarosa, contiene los propios anticuerpos contra la proteína de interés., de forma que es durante esta segunda operación cuando se forman los inmunoprecipitados, de tal manead que cada precipitado tendrá sus propias características migratorias, con lo cual, cada banda que veamos corresponderá a un antígeno diferente, y además podremos, según la posición del precipitado, conocer la cantidad de proteína así como la cantidad de anticuerpo específico en el gel, de manera que se puede realizar una relativa cuantificación de los componentes. La sensibilidad de este ensayo es similar al análisis inmunoelectroforético convencional, pero hay múltiples variaciones de la técnica que la hacen más útil según el propósito concreto. Este tipo de inmunoelectroforesis ha sido especialmente usado en estudios de proteínas serias y extractos biológicos.
La inmunoelectroforesis en cohete se denomina así por la forma característica del precipitado que se forma en el gel. El principio consiste en cargar en el gel, de forma consecutiva y en perpendicular a la dirección del campo eléctrico, diluciones seriadas con progresivo aumento de la cantidad de antígeno, mientras que el anticuerpo se encuentra repartido por el gel. Esto dará lugar a un precipitado cada vez mayor (a medida que hay más antígeno) que da un aspecto cónico que recuerda a un cohete). Estos métodos se utilizan para la cuantificación de proteínas serias antes de que aparecieran los métodos automatizados.
La contrainmunoelectroforesis consiste en el aprovechamiento de la distinta movilidad electroforética de los dos componentes implicados. Dado que las inmunoglobulinas migran hacia el polo negativo y las proteínas, dada su carga neta negativa, lo hacen hacia el positivo, se colocan de forma inversa a su migración, forzando así su encuentro. Es decir, cerca del polo positivo colocaremos el suero con los anticuerpos que irán contra nuestro antígeno, migrando estos hacia el polo negativo, mientras que cerca del polo negativo se cargarán los antígenos de interés, a sabiendas de que migrarán hacia el polo positivo. De este modo, ambos se encontrarán (según su movilidad electroforética) a una distancia intermedia, asegurando así la interacción.
Por último, la Inmunoelectroforesis de afinidad está basada en los cambios del patrón electroforético de las proteínas debido a su interacción específica con sus ligandos. Esta técnica se utiliza para estimar constantes de uníón. Algunas variantes de esta inmunoelectroforesis son similares a la cromatografía de afinidad dado el uso de ligandos inmovilizados.
La estructura laxa del gel permite la unión adicional de anticuerpos marcados radiactivamente para revelar proteínas específicas. Esta variación se ha usado en la identificación de alérgicos a través de su reacción con IgE.
Existen dos factores que determinan porque los métodos inmunoelectroforesis no son los más utilizados. Por un lado, requieren un trabajo intensivo y cierta experiencia manual. Además, requieren largos stocks de anticuerpos policlonales. Hoy en día, la electroforesis en gel es el método de elección para la caracterización de proteínas, ya que es fácil de realizar, altamente sensible y requiere un bajo número de anticuerpos específicos. Además, las proteínas son separadas sobre la base de su peso molecular, lo cual no sucede en la inmunoelectroforesis, aunque este método sigue siendo práctico cuando no se requieren condiciones reductoras.
Referencias
- ↑ «INMUNOELECTROFORESIS». Consultado el 4 de octubre de 2023.
Datos: Q855786
Esta página se editó por última vez el 21 jun 2024 a las 16:02.